Propiedades De Las Enzimas

Las enzimas son catalizadores biológicos selectivos de una eficiencia extraordinaria. Toda célula viva dispone de cientos de enzimas distintas que catalizan las reacciones esenciales para la vida. Estas enzimas catalizan las reacciones de las rutas metabólicas centrales, necesarias para mantener la vida.

La mayor parte de las reacciones catalizadas por enzimas no procederían a velocidades apreciables bajo condiciones fisiológicas en ausencia de las enzimas. El papel principal de las enzimas es aumentar las velocidades de tales reacciones. En forma típica, las reacciones catalizadas por las enzimas son de 103 a 1020 veces más rápidas que las mismas sin catalizar. 

Un catalizador es una sustancia que acelera la llegada a un equilibrio. Un catalizador puede cambiar en forma temporal durante la reacción, pero no cambia en el proceso general, porque se recicla para participar en varias reacciones. 

Los catalizadores aceleran las reacciones tanto hacia adelante como hacia atrás al convertir un proceso de uno o dos pasos en varios pasos menores, cada uno con menor necesidad de energía que la reacción no catalizada. 

Las enzimas son muy específicas para los reactivos o sustratos sobre los que actúan, y varía el grado de especificidad hacia el sustrato. Muchas enzimas poseen estereoespecificidad ya que sólo actúan sobre un estereoisómero del sustrato. Quizá el aspecto más importante de la especificidad de una enzima es la especificidad de reacción, esto es, la falta de formación de subproductos como desperdicios. La especificidad de las enzimas no sólo ahorra energía a las células sino que también evita la formación de productos metabólicos potencialmente tóxicos.

Las reacciones acopladas son una propiedad común de muchas enzimas; por ejemplo, la hidrólisis del ATP se acopla con frecuencia a reacciones metabólicas menos favorables. 

El nombre enzima deriva de una palabra griega que significa “en la levadura”. Indica que dichos catalizadores están presentes en el interior de las células. A finales del siglo XIX se estudió la fermentación de los azúcares por acción de células de levadura. Una generación después, James B. Summer cristalizó, en 1926, la primera enzima (ureasa) y demostró que era una proteína. En la siguiente década se purificaron cinco enzimas más y se encontró que también eran proteínas: pepsina, tripsina, quimotripsina,

carboxipeptidasa y la enzima Old Yellow (una flavoproteína NADPH oxidasa). Desde entonces se ha demostrado que casi todas las enzimas son proteínas, o proteínas más cofactores. Algunas moléculas de ARN también presentan actividad catalítica, pero usualmente no se les llama enzimas.

Propiedades principales de las enzimas: 1) pueden desempeñarse como catalizadores, 2) catalizan reacciones muy específicas, 3) pueden acoplar reacciones y 4) su actividad puede ser regulada.

Las seis clases de enzimas
Los nombres en la mayor parte de las enzimas metabólicas se forman agregando el sufijo —asa al nombre de sus sustratos, o a un término descriptivo de la reacción que catalizan. Por ejemplo, la ureasa tiene a la urea como sustrato. La alcohol deshidrogenasa cataliza la remoción de hidrógeno de los alcoholes (es decir, la oxidación de alcoholes). Unas pocas enzimas, como la tripsina y la amilasa, se conocen por sus nombres históricos. Las seis categorías son: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas.  a cada enxima se le asigna un número único, llamado número de clasificación de la enzima, o número EC (de enzyme classification). 

1. Las oxidorreductasas: catalizan las reacciones de oxidación-reducción. La mayor parte de esas enzimas se llaman, en general, deshidrogenasas. También hay otras enzimas en esta clase que se llaman oxidasas, peroxidasas, oxigenasas o reductasas. Un ejemplo de una oxidorreductasa es la lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27), llamada también lactato:NAD oxidorreductasa.

2. Las transferasas: catalizan las reacciones de transferencia de un grupo y pueden necesitar la presencia de coenzimas. Este grupo incluye las cinasas, enzimas que catalizan la transferencia de un grupo fosforilo del ATP. La alanina transaminasa, cuyo nombre sistemático es L-alanina:2-oxiglutarato aminotransferasa (EC 2.6.1.2), es un ejemplo típico de esta clase.

3. Las hidrolasas catalizan hidrólisis. Son una clase especial de transferasas donde el agua sirve como aceptor del grupo transferido. La pirofosfatasa es un ejemplo sencillo de una hidrolasa. El nombre sistemático de esta enzima es difosfato fosfohidrolasa (EC 3.6.1.1)

4. Las liasas catalizan la lisis de un sustrato, al generar un enlace doble; son reacciones de eliminación, no hidrolíticas y no oxidantes. Una liasa que cataliza una reacción de adición en las células es frecuentemente llamada sintasa. La piruvato descarboxilasa pertenece a esta clase de enzimas ya que descompone al piruvato en acetaldehído y dióxido de carbono. El nombre sistemático de la piruvato descarboxilasa, 2-oxo-ácido carboxi-liasa (EC 4.1.1.1.) casi nunca se emplea.

5.  Las Isomerasas catalizan cambios estructurales dentro de una misma molécula (reacciones de isomerización). La alanina racemasa

(EC 5.1.1.1) es una isomerasa que cataliza la interconversión de L-alanina y D-alanina. El nombre común es igual al nombre sistemático.

6. Las ligasas catalizan la ligadura o unión de dos sustratos. Las ligasas son usualmente llamadas sintetasas. La glutamina

sintetasa, o L-glutamato:amoniaco ligasa (formadora de ADP) (EC 6.3.12) usa la energía de la hidrólisis del ATP para unir glutamato y amoniaco para producir glutamina.

Experimentos Cinéticos: 

Cinética Química: 

En los experimentos cinéticos se examina la relación entre la cantidad de producto (P) que se forma en una unidad de tiempo ( [P]/ t) y las condiciones experimentales bajo las que se efectúa la reacción. La base de la mayor parte de las mediciones cinéticas es la observación de la rapidez, o velocidad (v), de una reacción, la cual varía en forma directa con la concentración de cada reactante (sección 1.4). Esta observación se expresa en una ecuación de velocidad.

La ecuación de velocidad refleja que la velocidad de una reacción depende de la concentración del sustrato ([S]). El símbolo k es la constante de velocidad e indica la velocidad o la eficiencia de una reacción. Cada reacción tiene una constante de velocidad diferente. La cantidad de producto ([P]) aumenta y la cantidad de sustrato ([S]) disminuye. 

Cinética Enzimática: 

Emil Fischer, en 1894, propuso que una enzima presenta una plantilla rígida, o cerradura, y que el sustrato es la llave que le corresponde. Los primeros estudios de cinética enzimática confirmaron que una enzima (E) se une a un sustrato para formar un complejo enzima-sustrato (ES). Los complejos ES se forman cuando los ligandos se unen de manera no covalente a sus lugares adecuados en el sitio activo. El sustrato reacciona en forma transitoria con la proteína catalizadora (y con otros sustratos, en una reacción multisustratos) para formar el producto de la reacción.

Esta reacción se efectúa en dos pasos distintos: la formación del complejo enzima-sustrato y la reacción química actual, acompañada por la disociación del producto. La velocidad total de una reacción enzimática depende de las concentraciones tanto del sustrato como del catalizador (la enzima). Cuando la cantidad de enzima es mucho menor que la cantidad de sustrato, la reacción depende de la cantidad de enzima. La concentración de una enzima en una muestra se puede determinar con facilidad comparando su actividad con una curva de referencia. Bajo estas condiciones experimentales hay cantidades suficientes de moléculas de sustrato para que cada molécula de enzima se una a una molécula de sustrato y forme un complejo ES; a esta condición se le llama saturación de la E con el S. 

La cinética enzimática se diferencia de la cinética química simple porque las velocidades de reacciones catalizadas por enzimas dependen de la concentración de la enzima y ésta nunca es un producto ni un sustrato de la reacción. Las velocidades también difieren porque el sustrato debe unirse a la enzima para poder convertirse en el producto.

 En una reacción catalizada por enzima, las velocidades iniciales se obtienen del progreso de las curvas, igual que en las reacciones químicas. 

Ecuación de Michaelis-Menten 

Las reacciones catalizadas por enzimas, como cualquier reacción química, se pueden describir en forma matemática como ecuaciones de velocidad. En ellas, varias constantes indican la eficiencia y especificidad de una enzima y en consecuencia son útiles para comparar las actividades de varias enzimas o para evaluar la importancia fisiológica de una determinada enzima. 

La pendiente de la curva de y 0 en función de [S] es la de una hipérbola rectangular. Las curvas hiperbólicas son indicativas de procesos donde hay una disociación simple, como se pudo apreciar en la disociación del oxígeno desde la oximioglobina.

La ecuación de una hipérbola rectangular es:

donde a es la asíntota de la curva (el valor de y a un valor de x infinito) y b es el punto del eje x que corresponde a un valor igual a a/2. En los experimentos de cinética enzimática, y y 0 y x [S]. El valor asintótico (a) se llama Vmáx. Es la velocidad máxima de la reacción a concentraciones de sustrato infinitamente grandes.

Una de las características de las curvas hiperbólicas es que parecen aplanarse a concentraciones moderadas de sustrato, a un valor que parece ser mucho menor que la Vmáx. La Vmáx real no se determina tratando de estimar la posición de la asíntota a partir de la forma de la curva. Más bien se determina en forma precisa y correcta ajustando los datos a la ecuación general de una hipérbola rectangular.
El término b en la ecuación general de una hipérbola rectangular se llama constante de Michaelis (Km), y se define como la concentración de sustrato cuando y 0 es igual a la mitad de la Vmáx. La ecuación completa de velocidad es: 

La ecuación de Michaelis-Menten describe la relación entre la velocidad inicial de una reacción y la concentración del sustrato.

Deducción dela ecuación de Michaelis-Menten: 

Una deducción común de la ecuación de Michaelis-Menten, debida a George E. Briggs y J. B. S. Haldane, es llamada la derivación del estado estable. Esta deducción postula que hay un intervalo de tiempo (llamado estado estable, o estado estacionario) durante el cual se forma el complejo ES a la misma velocidad con la que se descompone, de modo que la concentración de ES es constante. La velocidad  inicial se usa en la derivación del estado estable porque se asume que la concentración de producto ([P]) es insignificante. 

Al suponer que la concentración de ES en estado estable es constante, entonces la velocidad de formación de producto depende de la velocidad de la reacción química y de la velocidad de disociación de P para abandonar la enzima. 

La derivación del estado estable resuelve la ecuación para [ES], usando términos que se pueden medir, como la constante de velocidad, la concentración total de la enzima ([E]total) y la concentración de sustrato ([S]). Se supone que [S] es mayor que [E]total, pero no necesariamente es saturada.

Constante Catalítica 

Cuando la concentración de sustrato es alta, la velocidad total de la reacción es Vmáx y está determinada por la concentración de la enzima. La constante de velocidad observada bajo estas condiciones se llama constante catalítica, Kcat, y se define como sigue:

donde Kcat representa la cantidad de moles de sustrato convertidos en producto, por segundo y por mol de enzima (o por mol de sitio activo, para una enzima con multisubunidades) bajo condiciones de saturación. kcat indica la cantidad máxima de moléculas de sustrato convertidas en producto cada segundo por cada sitio activo. A eso se le llama con frecuencia número de recambio. La constante catalítica mide la rapidez con que determinada enzima puede catalizar una reacción específica; es una forma muy útil para describir la eficacia de una enzima. La unidad de kcat es s -1. El recíproco de kcat es el tiempo necesario para que haya un evento catalítico.

Significados de Km

esta ecuación define a Km como la relación de las constantes de velocidad combinadas para la descomposición de ES dividida entre la constante para su formación.

Km también es uno de los parámetros que determina la forma de la curva de y V0 en función de [S]. Es la concentración del sustrato cuando la velocidad inicial es la mitad del valor de Vmáx. Este significado es consecuencia directa de la ecuación general de una hipérbola rectangular.

Las constantes cinéticas indican la actividad enzimática y la eficiencia catalítica

las constantes cinéticas km y kcat se pueden usar para medir las actividades relativas de las enzimas y los sustratos. En la mayor parte de los casos, Km es una medida de la estabilidad del complejo ES, y kcat es similar a la constante de velocidad para la conversión de ES en E P, y cuando el sustrato no es limitante. la velocidad de reacción depende de las concentraciones del sustrato y de la enzima. En términos químicos, es una reacción de segundo orden, y la velocidad depende de una constante de velocidad de segundo orden, que se define por: 

La relación kcat/Km es útil para comparar las actividades de enzimas diferentes. También es posible evaluar la eficiencia de una enzima midiendo su capacidad catalítica. Este valor es igual a la constante de velocidad de una reacción en presencia de la enzima (kcat/Km) dividida entre la constante de velocidad de la misma reacción en ausencia de la enzima (kn).

Medición de Km y Vmáx

Los parámetros cinéticos de una reacción enzimática pueden producir información valiosa acerca de la especificidad y el mecanismo de la reacción. Los parámetros clave son Km y Vmáx ya que kcat se puede calcular si se conoce Vmáx. Los datos de Km y Vmáx para una reacción catalizada por enzima se pueden determinar de diversas maneras. Para obtener valores fiables de las constantes cinéticas, los puntos de [S]
se deben extender por abajo y por arriba de Km para producir una hipérbola. La ecuación de Michaelis-Menten se puede reacomodar para obtener valores de Vmáx y Km a partir de líneas rectas en gráficas. La transformación de uso más frecuente es la gráfica de doble recíproco, o de Lineweaver-Burk, en la que se grafican los valores de 1/v 0 contra los de 1/[S].

Se pueden obtener valores de kcat con mediciones de Vmáx sólo cuando se conoce la concentración absoluta de la enzima. Se pueden determinar los valores de Km aun con enzimas que no hayan sido purificadas siempre y cuando sea una sola la enzima en la preparación impura la que pueda catalizar la reacción observada.

Cinética de las reacciones con sustratos múltiples

Las mediciones cinéticas de reacciones con sustratos múltiples (o reacciones de multisustrato) son algo más complicadas que para cinéticas enzimáticas sencillas con un solo sustrato. La cinética enzimática simple que se describe en este capítulo se puede ampliar para diferenciar entre varias posibilidades mecanísticas para reacciones multisustrato, como las reacciones de transferencia de grupo.

Las reacciones de multisustrato pueden efectuarse de acuerdo con varios y distintos esquemas cinéticos llamados mecanismos cinéticos porque se deducen en su totalidad mediante experimentos cinéticos. Los mecanismos cinéticos son comúnmente representados con la notación introducida por W. W. Cleland. 

Las reacciones consecutivas (o secuenciales)  requieren que todos los sustratos estén presentes para que se libere algún producto. Estas reacciones secuenciales pueden ser ordenadas, con un orden obligatorio de enlazamiento de sustratos y de liberación de productos. También pueden ser aleatorias, sin orden obligatorio de enlazamiento o liberación.

En las reacciones ping-pong se libera un producto antes de que se enlacen todos los sustratos. En una reacción ping-pong de bisustrato, se enlaza el primer sustrato, se altera la enzima por sustitución y se libera el primer producto, después de lo cual se une el segundo sustrato, la enzima alterada regresa a su forma original y se libera el segundo producto. al mecanismo de ping-pong se le llama mecanismo de enzima sustituida. La unión y liberación de ligandos en un mecanismo de ping-pong se suelen indicar con líneas inclinadas. Las dos formas de la enzima se representan por E (no sustituida) y F (sustituida).

Inhibición reversible de enzimas

Un inhibidor de enzima (I) es un compuesto que se enlaza con una enzima e interfiere con su actividad. Los inhibidores pueden actuar evitando la formación del complejo ES o bloqueando la reacción química que lleva a la formación del producto. Por regla general, los inhibidores son moléculas pequeñas que se unen en forma reversible con la enzima que inhiben. Los inhibidores artificiales se usan en experimentos para investigar los mecanismos enzimáticos y para descifrar las rutas metabólicas. Algunas medicinas y muchos venenos son inhibidores de enzimas. inhibidores se unen en forma covalente con las enzimas y causando que la inhibición sea irreversible. La mayor parte de la inhibición de relevancia biológica es reversible. Los inhibidores reversibles se unen a las enzimas con las mismas fuerzas no covalentes que enlazan a sustratos y productos. Los inhibidores reversibles se diferencian de los irreversibles por su fácil eliminación de soluciones de enzima por métodos como diálisis o filtración en gel. El equilibrio entre la enzima libre (E) más el inhibidor (I) y el complejo EI se caracteriza por una constante de disociación. En este caso, a la constante se le llama constante de inhibición, Ki.

tipos de inhibición: 

Inhibición competitiva: 

Los inhibidores competitivos son los que se encuentran con más frecuencia en bioquímica. En la inhibición competitiva, el inhibidor sólo se puede unir a moléculas de enzima libre que no estén unidas a sustrato alguno. Cuando un inhibidor competitivo se une con una molécula de enzima, una molécula de sustrato no puede unirse a esa molécula de enzima. Al revés, la unión de sustrato y una molécula de enzima evita el enlazamiento de un inhibidor. En otras palabras, S e I compiten por unirse a la molécula de enzima. Más comúnmente, S e I se unen al mismo sitio de la enzima, el sitio activo. Este tipo de inhibición se llama inhibición competitiva clásica. el inhibidor se une a un sitio diferente, lo que altera el sitio de unión del sustrato y evita esta unión. A este tipo de inhibición se le llama inhibición competitiva no clásica. 

Inhibición acompetitiva: 

Los inhibidores acompetitivos sólo se unen al ES y no a la enzima libre. En la inhibición acompetitiva disminuye la Vmáx (aumenta 1/Vmáx) por conversión de algunas moléculas de E en la forma inactiva ESI. Ya que es el complejo ES el que se enlaza con I y la disminución de Vmáx no se revierte por la adición de más sustrato. Los inhibidores acompetitivos hacen descender la Km. 

Inhibición no competitiva: 

Los inhibidores no competitivos se pueden unir a la E o al ES y formar complejos inactivos EI o ESI, respectivamente. Esos inhibidores no son análogos del sustrato y no se enlazan en el mismo sitio que el S. El caso clásico de inhibición no competitiva se caracteriza por una disminución aparente de Vmáx (1/Vmáx parece aumentar) sin cambiar de la Km. La mayor parte de las enzimas no se apega a la forma clásica de inhibición no competitiva, donde no cambia Km. En la mayoría de los casos se afectan tanto la Vmáx como la Km, ya que la afinidad del inhibidor hacia la E es distinta que hacia ES. En esos casos se suelen llamar de inhibición mixta.

Usos de la inhibición enzimática: 

La inhibición enzimática reversible permite contar con un método poderoso para determinar la actividad enzimática y para alterarla en el tratamiento de enfermedades.

La industria farmacéutica recurre a estudios de inhibición enzimática para diseñar medicamentos de uso clínico. En muchos casos se usa un inhibidor natural de una enzima como punto de partida para diseñar un medicamento. En lugar de usar síntesis aleatorias y determinar inhibidores potenciales, algunos investigadores están recurriendo a un método más eficiente llamado diseño racional de un fármaco.

Los progresos en la síntesis de fármacos o medicamentos se ejemplifican por el diseño de una serie de inhibidores de la enzima purina nucleósido fosforilasa. Esta enzima cataliza una reacción de degradación entre fosfato y el nucleósido de guanosina. 

Inhibición enzimática irreversible: 

un inhibidor enzimático irreversible forma un enlace covalente estable con una molécula de enzima y elimina así las moléculas del sitio activo en la población enzimática. la inhibición irreversible ocurre por alquilación o acilación de la cadena lateral de un residuo de aminoácido en el sitio activo. Una aplicación importante de los inhibidores irreversibles es la identificación de residuos de aminoácidos en el sitio activo, por sustitución específica de sus cadenas laterales reactivas. Los inhibidores reversibles con estructuras que les permitan unirse en forma específica a un sitio activo son más útiles que los reactivos generales de sustitución. Estos inhibidores se llaman reactivos dirigidos al sitio activo, o marcadores de afinidad. El fosfato de bromohidroxiacetona es un marcador de afinidad para la triosa fosfato isomerasa, que cataliza la interconversión de fosfato de dihidroxiacetona y el 3-fosfato de gliceraldehído. Este inhibidor reacciona con la cadena lateral de un residuo de glutamato de la enzima. 

Enzimas alostéricas

Las enzimas alostéricas son enzimas cuyas propiedades son afectadas por cambios en la estructura. Los cambios estructurales son ocasionados por interacción con moléculas pequeñas. Una curva de y0 en función de [S] para una enzima alostérica con enlazamiento cooperativo del sustrato. Las curvas sigmoides se deben a la transición entre dos estados de la enzima. En ausencia del sustrato, la enzima está en el estado T. La conformación de cada subunidad presenta una forma en la que se une ineficientemente al sustrato y la velocidad de la reacción es baja. A medida que la concentración de sustrato aumenta, las moléculas de enzima comienzan a unirse al sustrato, aunque la afinidad de la enzima en el estado T sea baja. Cuando una subunidad se une al sustrato sufre un cambio de conformación que la convierte al estado R y se efectúa la reacción. Las propiedades cinéticas de la subunidad enzimática en el estado T y en el estado R son bastante distintas; cada conformación podría, por sí misma, exhibir una cinética normal de Michaelis-Menten.

Regulación de la actividad enzimática: 

La cantidad de una enzima se puede controlar regulando la velocidad de su síntesis o de su degradación. Este modo de control se presenta en todas las especies, pero con frecuencia se tarda de muchos minutos a horas sintetizar nuevas enzimas o degradar las enzimas existentes.
En todos los organismos, el control rápido, a escala de segundos o menos,  se puede de lograr mediante modulación reversible de la actividad de enzimas reguladoras. Se definen como aquellas cuya actividad se puede modificar en una forma que afecte la velocidad de una reacción catalizada por la enzima. (En muchos casos, tales enzimas reguladoras controlan un paso clave en una ruta metabólica. Cuando se describa la regulación de una ruta, a veces se designarán como enzimas reguladoras a las enzimas que regulan el flujo de metabolitos en una ruta). Las enzimas reguladoras se vuelven catalizadores más activos cuando aumenta la concentración de sus sustratos o cuando disminuyen las concentraciones de los productos de sus rutas metabólicas. Se vuelven menos activas cuando disminuyen las concentraciones de sus sustratos o cuando se acumulan los productos de sus rutas metabólicas. 

Las enzimas reguladoras se pueden clasificar por el método de su modulación: modulación alostérica no covalente o modificación covalente. Los fenómenos alostéricos son los responsables del control reversible de numerosas enzimas reguladoras. Estas enzimas disponen de un segundo sitio de unión para el ligando, alejado de sus centros catalíticos. Este segundo sitio se llama sitio regulador o sitio alostérico. Un inhibidor o activador alostérico, que también se llama modulador alostérico o efector alostérico, se une al sitio regulador y causa un cambio de conformación en la enzima reguladora.

Propiedades generales de las enzimas alostéricas

1. Las actividades de las enzimas alostéricas cambian debido a inhibidores y activadores metabólicos.
2. Los moduladores alostéricos se enlazan en forma no covalente a las enzimas que regulan. Muchos moduladores alteran la Km de la enzima para un sustrato; otros, la Vmáx de la enzima. 
3. Los moduladores mismos no son alterados químicamente por la enzima. Con pocas excepciones, las enzimas reguladoras son proteínas de subunidades múltiples. (Sin embargo, no todas las enzimas de subunidades múltiples son reguladoras). Las cadenas polipeptídicas individuales de una enzima reguladora pueden ser idénticas o diferentes.
4. Toda enzima sujeta a regulación alostérica posee cuando menos un sustrato para el cual la curva de v0 en función del [S] es sigmoidea en lugar de hiperbólica. 

Dos teorías de la regulación alostérica: 

La teoría concertada, o teoría inducida por simetría, fue inventada para explicar la unión cooperativa de ligandos idénticos como los sustratos.

 La teoría secuencial, o teoría inducida por ligando, es una proposición más general. Se basa en la idea de que un ligando puede inducir un cambio en la estructura terciaria de la subunidad a la que se une. Este complejo de subunidad-ligando puede cambiar las conformaciones de las subunidades vecinas hasta diversos grados. La teoría secuencial puede explicar la cooperatividad negativa, una disminución en la afinidad, cuando las moléculas de ligando se unen a un oligómero.